Expresión en paratiroides del receptor-sensor del calcio y set point PTH-calcio in vivo en pacientes con hiperparatiroidismo primario


Filomena Cetani, Antonella Picone, Paola Cerrai, Edda Vignali, Simona Borsari, Elena Pardi, Paolo Viacava, Antonio Giuseppe Naccarato, Paolo Miccoli, Olga Kifor, Edward M. Brown, Aldo Pinchera y Claudio Marcocci
Dipartimento di Endocrinologia e Metabolismo, Ortopedia e Medicina del Lavoro (F.C., A.P., P.C., E.V., S.B., A.P., C.M.), Dipartimento di Oncologia (P.V., A.G.N.) e Dipartimento Chirurgia (P.M.),
Universita`di Pisa, 56125 Pisa, Italy; and Endocrine-Hypertension Division, Department of Medicine,
Brigham and Women's Hospital (O.K., E.M.B.), Boston, Massachusetts

J Clin Endocrinol Metab 85: 4789-4794, 2000


Introducción
El hiperparatiroidismo primario se caracteriza por anormalidades en la regulación de la proliferación de células paratiroideas y la secreción de PTH. 
Las células paratiroideas in vivo e in vitro responden a concentraciones crecientes en de calcio iónico extracelular con una rápida disminución en la secreción de PTH. Este efecto es mediado por una interacción directa de los iones de calcio con un receptor-sensor de calcio, acoplado a la proteína G y la concentración de calcio sérico que inhibe a la mitad del máximo de liberación de PTH se define como set point de PTH-calcio. 
Los pacientes con hiperparatiroidismo primario requieren una mayor concentración de calcio para inhibir la secreción de PTH, pero la base molecular para esta anormalidad permanece sin ser elucidada. 
Ha sido reportado en un reciente estudio una reducida expresión del ARNm de un promotor del receptor del calcio y una menor expresión de ARNm de receptor del calcio y la proteína del receptor-sensor del calcio, comparado con el tejido paratiroideo normal, en adenoma de paratiroides y con la de las glándulas hiperplásicas de pacientes con hiperparatiroidismo urémico. 

Objetivo
Evaluar la expresión de la proteína receptora de calcio en una serie de adenomas de paratiroides esporádicos e investigar la relación entre el nivel de la expresión del receptor de calcio y varios parámetros clínicos, incluyendo la secreción de PTH medida in vivo.

Población y métodos
-Se evaluó a 36 pacientes con hiperparatiroidismo primario esporádico, incluyendo diez varones de 33-70 años de edad (media:50 años) y 26 mujeres, de 27-76 años de edad (media: 55,7 años). 
-El diagnóstico de hiperparatiroidismo primario esporádico fue basado en una calcemia elevada (mayor de 1,32 mmol/l) y PTH mayor de 65 pg/ml con una historia familiar negativa. 
-29 pacientes y 10 sujetos normales (8 mujeres y 2 varones) participaron en el estudio del set point de PTH-calcio. 
-Para estudiar el set point de PTH-calcio se realizó extracciones de sangre basales para medir calcemia y PTH intacta. Se infundió gluconato de calcio endovenoso en 3 horas a razón de 3 mg de calcio elemental/kg/Hora. Se extrajo sangre cada 30 minutos para medición de calcemia y PTH intacta. 
-Se definió set point de PTH-calcio como la calcemia correspondiente a la mitad de de la inhibición máxima de los valores de PTH. 
-Como controles de tejido de paratiroides normal se utilizaron biopsias de glándulas paratiroides de pacientes normocalcémicos operados por bocio nodular y de paratiroides bovinas normales. 
-Para la inmunohistoquímica se utilizó anticuerpos policlonales antirreceptor de calcio, generado en conejos. 
-Cada sección de paratiroides fue observada por dos investigadores independientes. La presencia de una tinción distintiva en la superficie celular de las células principales con una distribución anular, la cual fue abolida por la preabsorción del anticuerpo del receptor del calcio con el péptido específico, fue considerada como específica. 
La intensidad general de la tinción específica fue evaluada como negativa, débil, moderada, o intensa y los adenomas fueron agrupados en cuatro categorías de acuerdo a esta tinción. En el caso de la tinción intensa, el patrón y la intensidad de tinción fueron similares a la de los tejidos controles. 

Resultados
Los pacientes tuvieron adenomas paratiroideos únicos. 
Las concentraciones prequirúrgicas de calcio iónico sérico y PTH intacta variaron entre 1,32-1,88 milimoles por litro (media, 1,49 +/- 0,13 mmol por litro) y 62-1490 pg/ml (media,202 ± 252 pg/ml), respectivamente. Los volúmenes de los adenomas variaron de 0,16-9,82 ml (media, 1,18 ± 1,66 ml). 
Se encontró una correlación lineal entre el volumen del adenoma y la PTH basal (r = 0,87; p = 0,0001) con los niveles de calcemia (r = 0,4; p = 0,008). 
En los 36 casos, la remoción del tumor fue seguido por una normalización persistente de la calcemia y de la PTH sérica. 


Test de infusión del calcio
Veintinueve pacientes fueron sometidos al test de infusión del calcio prequirúrgicamente para evaluar el set point PTH-calcio. Durante la infusión, la calcemia incrementó progresivamente en todos los pacientes (un incremento medio por encima del basal, 0,2 +/- 0,06 mmol por litro). La concentración de PTH (expresada como porcentaje de disminución comparada con el valor basal) no mostró cambios significativos (< 10%) en 3 casos a pesar de un marcado incremento en la calcemia (de 1,67, 1,53, y 1,69 milimoles por litro a 1,94; 1,72; 1,95 milimoles por litro, respectivamente). Estos tres pacientes estaban entre los de más elevados niveles de calcemia y PTH prequirúrgica. En los 26 casos restantes se encontró un grado variable de inhibición de la secreción de PTH, variando entre 21-73% (media,54 ± 15%). 
En 10 sujetos normales el set point de PTH-calcio medio fue de 1,23 +/- 0,4 milimoles por litro (rango, 1,18-1,29 milimoles por litro). 
En los pacientes con hiperparatiroidismo primario los set point individuales de PTH-calcio variaron de 1,38-1,93 milimoles por litro (media, 1,53 ± 0,14 milimoles por litro; p = 0,001 vs. los sujetos normales) y se correlacionaron significativamente con los niveles de calcemia basales (r = 0,96; p = 0,0001) y el volumen del adenoma (r = 0,5; p=0,01). 
No se observó correlación entre el set point de PTH-calcio y los niveles basales de PTH o entre el porcentaje máximo de inhibición de PTH y el volumen del adenoma y los niveles basales de PTH o calcemia. 

Inmunohistoquímica
Las adenomas fueron clasificados en cuatro categorías de acuerdo a la intensidad de la tinción inmunohistoquímica: 5 (14%) mostraron una tinción con intensidad similar a la de la paratiroides normal (+ + +),10 (27%) evidenciaron una tinción moderada (+ +),16 (45%) mostraron una tinción débil (+), y 5 (14%) fueron negativos (-).
La especificidad de la tinción fue confirmada en cada caso por la abolición de la tinción luego de la preabsorción del anticuerpo antirreceptor del calcio con el péptido específico contra el cual estaba dirigido. 
Para validar el método de score inmunohistoquímico, la expresión de la proteína receptor del calcio fue también analizada en un subgrupo (n=6) de adenomas de paratiroides, utilizando la técnica de Western Blot. Se identificó 2 bandas mayores de 120-150 kDa, correspondientes al receptor glicosilado intacto (glándulas paratiroides humanas normales), y sus intensidades fueron variadamente reducidas en las membranas de las glándulas patológicas. Estas dos bandas estuvieron ausentes cuando el antisuero reabsorbido por el péptido fue utilizado para el blotting. Las bandas más tenues, con menor peso molecular se presentan en la mayoría de las muestras de adenoma, pero no el tejido paratiroideo normal, y más probablemente representen un producto de degradación del receptor del calcio y parcialmente desaparecieron cuando se utilizó el antisuero para el receptor del calcio preabsorbido. Se verificó una buena correlación entre la intensidad de las bandas de inmunorreactividad de receptor del calcio en el Western Blot y el scoring inmunohistoquímico de las muestras individuales. 

Relación entre la expresión del receptor del calcio y la clínica y los parámetros bioquímicos
Se observó una diferencia estadísticamente significativa entre los valores de set point medios de PTH-calcio (en los 26 casos en los cuales pudo ser estimado) en los cuatro grupos de adenomas clasificados de acuerdo a la intensidad de la inmunotinción (p = 0,025; F = 3,78). En particular, el set point medio de PTH-calcio fue significativamente mayor en el grupo de pacientes cuyo adenoma paratiroides fue clasificado como negativo en la inmunohistoquímica que en aquellos clasificados como débil o moderada. En contraste, no hubo diferencia en los cuatro grupos en las calcemias prequirúrgicas, PTH, o volumen del adenoma, aún si la calcemia y el volumen del adenoma tendieron a ser mayores en los pacientes con ausencia o marcada disminución en la expresión de receptor del calcio comparados con los otros grupos. Interesantemente, la expresión de receptor del calcio fue marcadamente reducida en los tres pacientes con PTH no suprimible durante la infusión del calcio. 

Discusión
La regulación anormal de la secreción de PTH por el calcio juega un importante rol en la fisiopatología de la hipercalcemia en el hiperparatiroidismo primario. En los estudios in vitro se ha demostrado que las células adenomatosas de paratiroides segregan más PTH a cualquier nivel dado de calcemia y están seteadas para mantener la calcemia en un constante, pero en un nivel mayor que el normal. Para explicar este hallazgo, Parfitt y colaboradores sugirieron que las células paratiroideas patológicas continúan proliferando hasta que el tamaño del adenoma es tal,que la cantidad de PTH segregada es suficiente para incrementar la calcemia al nivel correspondiente a un set point dado de la glándula paratiroides patológica, y por tanto se alcanza un estado de equilibrio. Estos conceptos están de acuerdo con la observación in vivo de que los pacientes con hiperparatiroidismo primario tienen un set point de PTH-calcio mayor que los sujetos normales. 
En esta serie hubo también una disminución variable en la expresión de la proteína del receptor del calcio evaluada por inmunohistoquímica en tumores paratiroides y comparados con glándulas paratiroides normales de sujetos normocalcémicos. Los análisis de Western Blot de las proteínas de membrana aisladas de glándulas paratiroides normales y patológicas, utilizando los mismos anticuerpos antirreceptor del calcio muestran que la mayoría de las proteínas marcadas tienen una masa molecular compatible con la de la proteína del receptor del calcio glicosilada. La intensidad de tinción no se correlacionó con los niveles basales de calcemia o niveles de PTH o con el volumen del adenoma. En esta serie, 5 adenomas de paratiroides tuvieron el score de negativo para la expresión del receptor del calcio.
En tres de estos casos, los niveles de PTH in vivo fueron esencialmente no suprimibles durante la infusión de calcio, lo cual podría ser compatible con los niveles marcadamente anormales de la expresión del receptor del calcio en estas glándulas. En cualquier caso, la cuestión de si la expresión reducida de la proteína del receptor de calcio representa un fenómeno primario o secundario es aún un asunto de discusión. 
En pacientes con hiperparatiroidismo primario hay un incremento en el set point de la secreción de PTH regulada por calcio, y ha sido sugerido que una reducción en la proteína del receptor del calcio podría dar cuenta de esta anormalidad. 
Los estudios in vitro han demostrado que hay una correlación entre la pérdida progresiva de supresión de la secreción de PTH y una reducción del ARN mensajero del receptor del calcio y la expresión de la proteína en las células de paratiroides bovinas en cultivo. 
Además, una relación entre el set point y el número de alelos anormales de receptor del calcio ha sido reportada en hipercalcemia hipocalciúrica familiar y en el hiperparatiroidismo neonatal severo. 
Para enfocar esta cuestión se evaluó in vivo la secreción de PTH durante la infusión de calcio y se comparó los resultados con la expresión de proteína del receptor de calcio en las adenomas de paratiroides resecados quirúrgicamente del mismo paciente. La mayoría de estos pacientes mostraron incrementos en el set point de PTH-calcio comparados con el que había sido reportado en los sujetos normales, y la calcemia basal fue el más potente predictor de este cambio. Además, hubo una diferencia estadísticamente significativa entre el set point medio de PTH-calcio en los cuatro grupos de pacientes subdivididos de acuerdo a la intensidad de inmunotinción del receptor del calcio de los adenomas paratiroides. En particular, el set point medio de PTH-calcio fue mayor en el grupo de pacientes con tinción negativa para el receptor de calcio, sugiriendo que la aparente falta de expresión del receptor del calcio se asocia con una anormalidad más severa en el control de la liberación de PTH regulada por calcio. Finalmente, una correlación significativa, fue observada entre el set point de PTH-calcio y el volumen del adenoma, indicando que la hiperplasia paratiroidea puede también jugar un rol en la anormalidad de la secreción de PTH en el hiperparatiroidismo primario. Este mecanismo patogénico puede ser particularmente relevante en el grupo de adenomas con tinción (+ + +) para receptor del calcio similar al del tejido paratiroideo normal. 
En resumen, los resultados del presente estudio son compatibles con los datos previos que muestran una reducción sustancial de la expresión de receptor del calcio en los adenoma paratiroideo se de pacientes con hiperparatiroidismo primario. También sugieren que hay una relación entre la expresión aparente de proteína del receptor del calcio y la anormalidad del set point de PTH-calcio, induciendo a pensar que un contenido reducido de receptor podría tener un rol importante en la patogénesis del hiperparatiroidismo primario.